菌種復(fù)蘇實驗流程

1、厭氧條件準(zhǔn)備

根據(jù)菌株供應(yīng)商提供的培養(yǎng)信息準(zhǔn)備相應(yīng)的固體和液體培養(yǎng)基，如果是厭氧菌株，準(zhǔn)備厭氧倉條件。

2、菌株復(fù)蘇

打開安瓿瓶，用0.5-1mL液體培養(yǎng)基重懸管內(nèi)的菌體。若菌種為真菌，則建議將菌懸液轉(zhuǎn)移至5-6mL無菌水中室溫孵育數(shù)小時，孵育時間越長，菌株的活性越高。

若是進(jìn)行液體培養(yǎng)，則將菌懸液全部取出，接種至5-6mL液體培養(yǎng)基中。若為固體平板培養(yǎng)，則需要將菌懸液按200μL/板的量接種至固體培養(yǎng)基平板上。

在合適的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，通常情況下會在2-5天內(nèi)長菌，少數(shù)菌株會需要更長的培養(yǎng)時間。

3、菌種復(fù)蘇后，對菌種進(jìn)行保存，采用一代測序的方法進(jìn)行菌種鑒定，來判斷復(fù)蘇出來的菌種是否符合預(yù)期。

4、根據(jù)老師要求，對復(fù)蘇成功的菌株，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

5、菌株擴(kuò)培后，再次進(jìn)行一代測序，來判斷擴(kuò)培菌株是否符合預(yù)期。

6、采用qPCR的方法，對擴(kuò)培的菌株進(jìn)行拷貝數(shù)的定量，根據(jù)rrnDB中菌株的拷貝數(shù)，進(jìn)行菌株個數(shù)的轉(zhuǎn)化。如果菌種水平?jīng)]有拷貝數(shù)信息，那么根據(jù)更高一個級別進(jìn)行轉(zhuǎn)化。并稀釋或濃縮到老師需要的菌株濃度。

7、根據(jù)需求對菌株進(jìn)行分裝，如果是厭氧菌株，則在厭氧倉中進(jìn)行，并獨立包裝，加上吸氧劑抽真空保存。方便老師后繼使用方便。

8、活菌的運(yùn)輸：如果菌株中加了凍存試劑，必須采用干冰運(yùn)輸，老師收到菌株后放在-80℃保存。如果老師指/定要求是新鮮菌液，那么采用冰袋運(yùn)輸，老師收到菌株后放在4℃冰箱保存，并盡快使用掉，不宜在4℃冰箱中長期保存。

注意事項

1、針對厭氧菌株，以上操作都必須在無氧環(huán)境下進(jìn)行。若在有氧環(huán)境下復(fù)蘇厭氧菌，會導(dǎo)致菌株的活性會大幅下降，甚至復(fù)蘇失敗。

2、必須在符合相應(yīng)的生物安全等級的實驗室中，由接受過專業(yè)訓(xùn)練的人員進(jìn)行以上所有操作。

3、操作過程中，需要全程做好防護(hù)措施。實驗過程中產(chǎn)生的廢棄物必須先滅菌，然后才能丟棄。

4、致病性的菌株公司不提供相應(yīng)的服務(wù)。